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【转载】逆转录引物的选择  

2015-07-24 12:22:59|  分类: 分子生物 |  标签: |举报 |字号 订阅

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逆转录引物的选择

发布时间:2015-07-10 14:43 |  点击次数:190

根据实验目的不同逆转录引物可以从Oligo dT,随机引物(Random hexamers)和基因特异性引物(GSP)中进行选择。

Oligo dT 
适用于具有Poly A尾的RNA。如果模板为真核生物来源,一般情况下首选Oligo dT,与真核生物mRNA的3’ Poly A尾配对,适合长链甚至全长mRNA的逆转录。其对RNA样品的质量要求较高,即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

随机引物 
适合各种RNA的逆转录,包括mRNA, rRNA, tRNA均可以作为Random hexamers的模板,尤其适合模板丰度很低的情况(比如某个gene表达量很低)。选择随机引物时,第一链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板,然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系,一般建议每5μg总RNA的随机引物的用量为50ng,如果每5μg总RNA的随机引物的用量超过250ng,可能会导致小片段产物(<500bp)的增加和长片断、全长产物产物的降低。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高,或者模板为原核生物来源,使用Oligo dT或基因特异性引物 (GSP)无法有效引导cDNA合成时,可使用Random hexamers为引物。

基因特异性引物 
与模板序列互补的引物,适用于目的序列已知的情况。可用于一步法RT-PCR,只产生需要的cDNA,后续的PCR扩增更特异。但有些情况下,用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成。这时,可改用Oligo dT或 Random hexamers重新进行逆转录。

若后续实验为qPCR,可将Oligo dT与Random hexamers混合使用,可使mRNA的各个区域均能以相同效率引发cDNA合成,有助于提高定量结果的重复性。

HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit基于HiScript? Reverse Transcriptase,HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit基于HiScript? II Reverse Transcriptase,包含合成高质量第一链cDNA所需的所有成分,可根据需要,选择Oligo dT或Random hexamers作为逆转录引物。适合于后续的PCR、qPCR以及PCR克隆。

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